ABSTRACT

Objective: To study the effect of perillyl alcohol on the gene expression of human pulmonary adenocarcinoma cells. Methods: Pulmonary adenocarcinoma cells were incubated with perillyl alcohol in dilutions ranging from 0.03% to 0.0003% for 48 hours. Alterations were observed in the cell morphology, and cell viability was quantified using [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] assays. Protein synthesis of samples previously targeted with S35 was analyzed using electrophoresis on a polyacrylamide gel. Expression of the proteins p53 and p44/42 was determined using the Western blot method. Results: After 48 hours of incubation, greater numbers of morphological alterations were observed in cells treated with the 0.03% perillyl alcohol dilution than in those treated with perillyl alcohol diluted to 0.003% or further. Treatment with perillyl alcohol dilutions of 0.03%, 0.003% and 0.0003% inhibited cellular viability by 60.17% (p < 0.001), 15.62% (p < 0.001) and 11.53% (p < 0.05), respectively. The results show that 28-kDa, 42-kDa and 110-kDa proteins were induced. No statistically significant effect on p53 expression was observed. In comparison with the expression of a-tubulin, the 0.003% perillyl alcohol dilution induced an increase in p42 phosphorylation and a marked decrease in p44 phosphorylation. Conclusion: The results suggest that there are other, previously undescribed, metabolic pathways for perillyl alcohol effects in human pulmonary adenocarcinoma cells.

Keywords: Adenocarcinoma; Lung neoplasms; Monoterpenes; Cell culture; Lung/cytology

RESUMO

Objetivo: Estudar a ação do álcool perílico na expressão gênica de células de adenocarcinoma de pulmão humano. Métodos: Incubaram-se células de adenocarcinoma de pulmão com álcool perílico em diluições que variaram entre 0,03% e 0,0003% por 48 horas. Observaram-se as alterações na morfologia celular e quantificou-se a viabilidade celular pelo método do MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl)-2,5 difeniltertrazolim brometo). Analisou-se a síntese de proteínas das amostras previamente marcadas radioativamente com 35S, através de eletroforese em gel de poliacrilamida. Determinou-se a expressão das proteínas p53 e p42/44 através do método de Western Blot. Resultados: Após 48 horas de incubação, observaram-se alterações na morfologia celular para a diluição de 0,03% de álcool perílico, as quais foram pouco verificadas em diluições superiores a 0,003%. A inibição da viabilidade celular foi de 60,17% (p < 0,001), 15,62% (p < 0,001) e 11,53% (p < 0,05) para as diluições de 0,03%, 0,003% e 0,0003% de álcool perílico, respectivamente. Os resultados mostram a indução de proteínas de 110 kDa, 42 kDa e 28 kDa. Não se observou variação estatisticamente significativa para a expressão da proteína p53. Em comparação com a expressão de a-tubulina, a diluição de 0,003% de álcool perílico provocou uma diminuição marcante da fosforilação da p44 e um aumento da fosforilação da p42. Conclusão: Os resultados apresentados sugerem novos caminhos metabólicos da ação do álcool perílico em células de adenocarcinoma de pulmão humano.

Palavras-chave: Adenocarcinoma; Neoplasias pulmonares; Monoterpenos; Cultura de células; Pulmão/citologia

INTRODUÇÃO

Pacientes com câncer de pulmão possuem uma taxa de sobrevida extremamente baixa, o que reflete o seu alto índice de mortalidade. Os principais motivos desse fato são o diagnóstico tardio da doença e a ineficácia dos tratamentos utilizados. Por essas razões, faz-se necessária a busca de novos tratamentos quimioterápicos.

Uma alternativa que vem sendo pesquisada para o tratamento de tumores sólidos é a utilização do álcool perílico (AP). O AP é um monoterpeno isolado dos óleos essenciais de menta, cerejas e sementes de aipo, dentre outras plantas.(1) Estudos em animais mostram que o AP é um agente quimio-terápico eficaz na regressão de tumores de mama,(2) pâncreas,(3) fígado(4) e próstata,(5) e agente quimiopreventivo nos tumores de cólon,(6) melanomas(7) e neuroblastomas.(8) O AP atua na indução de apoptose de células tumorais sem afetar as células normais e pode reverter as células tumorais para um estágio diferenciado.(1) A inibição da transdução de sinal através da membrana pelo AP resulta da não ancoragem da proteína Ras através da inibição de sua isoprenilação. Em adenocarcinoma pulmonar, a proteína Ras apresenta mutação em 19% dos casos, daí constituir-se em um importante alvo terapêutico.(9)

Com base nessa problemática, o objetivo deste trabalho foi estudar a ação do álcool perílico na expressão gênica de células de adenocarcinoma de pulmão humano, para melhor compreender seu mecanismo de ação como agente quimioterápico.

MÉTODOS

Foram obtidas células de adenocarcinoma de pulmão A549 da American Type Culture Collection, as quais foram cultivadas sob a forma de monocamadas em meio RPMI 1640 Gibco. Para o subcultivo das células, lavaram-se as monocamadas confluentes (1,0 x 107 células/garrafa) em solução salina fosfato PBS, pH 7,2 (0,8% NaCl, 0,02% KCl, 0,15% Na2HPO4, 0,02% KH2PO4.H2O), fez-se o tratamento, rapidamente, com solução de tripsina (0,25% em PBS) e ressuspendeu-se, por agitação suave, em meio de cultura novo. Adicionou-se o álcool perílico (Sigma-Aldrich, 96%) às monocamadas de células semiconfluentes nas diluições de 0,03%, 0,003 % e 0,0003%, as quais foram mantidas a 37ºC, em estufa de gás carbônico, por 48 horas.

Quantificou-se a viabilidade celular através do método do MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl)-2,5 difeniltertrazolim brometo), conforme descrito por Mosmann.(10) Resumidamente, cresceram 104 células/poço em placas de 96 poços que, 24 horas depois, foram incubadas com álcool perílico nas diferentes diluições anteriormente citadas. Após 48 horas, adicionaram 20 µL de MTT (5µg/ml) a cada poço e as células permaneceram no escuro, a 37°C, por quatro horas. Posteriormente, descartou-se o sobrenadante e dissolveu-se o precipitado com 150 µL de dimetil sulfóxido. A leitura foi feita em leitor de ELISA (BenchMark, Biorad) no comprimento de onda de 570 nm e filtro de referência de 630 nm.
Incubaram-se as monocamadas de células semiconfluentes com AP nas diluições de 0,03%, 0,003% e 0,0003%. Após 48 horas, retirou-se o meio de cultura, o qual foi substituído pelo meio Eagle's Minimum Essencial Médium, isento de soro e contendo 40 µCi/mL de metionina, durante 120 minutos. Após a incorporação, tratou-se a monocamada celular com tampão: Tris-HCl, pH 6,8, 62,5 mM; sódio dodecil sulfato (SDS), 2%; glicerol, 10%; 2 mercaptoetanol, 5%; azul de bromofenol, 0,001%. Foram então analisadas as proteínas marcadas radioativamente através de auto-radiografia.

Analisaram-se as proteínas fracionadas por eletroforese em gel de poliacrilamida a 12%, segundo a técnica descrita por Laemmli, em 1970.(11) Determinou-se o peso molecular das proteínas por co-eletroforese de proteínas de peso molecular conhecido (Life Technology, Inc; Gaithersburg, MD): miosina (200 kDa), fosforilase B (97,4 kDa), albumina sérica bovina (68 kDa), beta-lactoglobina (18,4 kDa) e lisosima (14,3 kDa). Coraram-se os géis com azul de Comassie, os quais, após secagem, foram expostos ao filme radiográfico Kodak X-Omat YAR- S (Kodak, USA).

Obteve-se o traçado densitométrico da auto-radiografia utilizando-se o aparelho LKB 2202 Ultrascan Laser Densitometer. O traçado representa o perfil protéico da auto-radiografia das células-controle e das incubadas com álcool perílico após 48 horas.

Para o teste de Western Blot para as proteínas cinases p44/42 (ERK1 e ERK2), a-tubulina e p53 fracionaram-se as proteínas em gel de SDS - PAGE a 12%,(11) os quais foram transferidos para a membrana de nitrocelulose por eletroblotting e submetidos à reação de imunodetecção, separadamente para cada anticorpo. Bloqueou-se a membrana de nitrocelulose da marca Gibco BRL - Life Technologies, com solução a 5% p/v de leite em pó desnatado em TBST (10 mM Tris, pH 8,3; 150 mM NaCl; 0,15% Tween 20).

Após três lavagens de quinze minutos em tampão TBST, incubou-se a membrana, separadamente, com os anticorpos monoclonais anti-p53 (Mab 1801, Gibco), anti-a-tubulina (Sigma monoclonal anti-a-tubulin clone B-5-1-2) e anti-ERK 1/2 (Phospho-p44/42 MAPK (Thr 202/ Try 204) E10 monoclonal antibody), Cell signaling techonology) por 24 horas, em diluições recomendadas pelo fabricante. Posteriormente, incubou-se novamente a membrana, por uma hora, com o anticorpo secundário anti-IgG de camundongo, conjugado à peroxidase (Amersham Biosciences, USA), na diluição de 1:1.000. Visualizaram-se os complexos pelo kit de revelação de quimilnescência da Amersham (Enhanced Chemiluminescence System- ECL, Amersham) com exposição a um filme radiográfico Kodak X-Omat YAR- S (Kodak, USA).

Realizaram-se três experimentos independentes em triplicatas e a significância estatística foi analisada através do teste t de Student, não pareado. Foram consideradas diferenças significativas aquelas que apresentaram p < 0,05.(12-13)

RESULTADOS

Estudaram-se as alterações na morfologia celular em diluições de AP compreendidas entre 0,03% e 0,0003%. A Figura 1A mostra a morfologia das células não incubadas com AP. A Figura 1B mostra que a diluição de 0,03% provocou intensa lise celular, a qual foi pouco observada em diluições de 0,003% e 0,0003% (Figuras 1C e 1D), quando em comparação com células-controle (Figura 1A). A inibição da viabilidade celular, quantificada através do método do MTT, foi de 60,17% (p < 0,001), 15,62% (p < 0,001) e 11,53% (p < 0,05) para as diluições de AP de 0,03%, 0,003% e 0,0003%, respectivamente (Figura 2). Estes resultados estão de acordo com as alterações de morfologia celular mostradas na figura 1.





Com o objetivo de verificar se as alterações no controle da expressão gênica ao nível da síntese protéica poderiam estar associadas aos resultados mostrados nas Figuras 1 e 2, analisou-se o padrão de proteínas através da incorporação de precursor radioativo (Figura 3).





Os resultados mostram que o tratamento com 0,003 % de AP leva à indução de proteínas de 110 kDa, 42 kDa e 28 kDa, não observada na diluição de 0,0003%, como indicam as setas na auto-radiografia (Figura 3A) e no traçado densitométrico (Figura 3B).





Como o AP levou à diminuição da viabilidade celular (Figura 2), analisou-se, também, o possível envolvimento de proteínas presentes nas vias de proliferação e apoptose (Figura 4). Determinou-se a expressão das proteínas p53 e p44/42 através do método de Western Blot. A proteína a-tubulina foi utilizada como controle interno. Observou-se a mesma quantidade de a-tubulina para todas as diluições (Figura 4A), exceto para a diluição de 0,03% de AP, em que a viabilidade celular se encontrou reduzida (Figura 2). Os resultados apresentados na Figura 4B mostram que não ocorreu variação estatisticamente significativa para a p53. Em comparação com a expressão de a-tubulina, a diluição de 0,003% de AP provocou uma diminuição marcante da fosforilação da p44 e um aumento da fosforilação da p42 (Figura 4C).





DISCUSSÃO

A compreensão do perfil molecular dos tumores humanos é essencial para o uso efetivo de agentes quimioterápicos. As alterações celulares mostradas neste trabalho sugerem que o AP pode ser um potencial quimioterápico em câncer de pulmão. Os resultados apresentados mostram um novo mecanismo de ação desse agente, através de alterações das vias que regulam o crescimento e a diferenciação celular.

As proteínas cinases p42 e p44 estão presentes na cascata de cinases que regulam o crescimento e a diferenciação celular. As mitogen actived protein cinases são ativadas por uma variedade de fatores extracelulares, incluindo fatores de crescimento, hormônios e neurotransmissores.(14-16) A ativação das mitogen actived protein cinases ocorre através da fosforilação da tirosina e treonina (202 e 204 de mitogen actived protein cinases humanas (ERK 1) ou 183 e 185 de rato (ERK 2)) na seqüência aminoácidos treonina e tirosina (TEY) por uma única cinase.(17-18) Os resultados indicam que o AP é capaz de induzir a fosforilação da proteína p42 para as diluições de 0,003% e 0,0003% em 48 horas (Figura 4C) e de inibir a fosforilação da p44. O significado fisiológico desta ativação/inibição in vitro ainda não está bem estabelecido.

Os resultados mostram, pela primeira vez, que a ERK1/2 é um dos alvos moleculares da modulação da resposta ao AP em células de adenocarcinoma de pulmão humano. O AP estaria atuando diretamente no estado de fosforilação da cinase regulada por sinal extracelular (ERK), e não somente através da inibição da farnesilação da proteína Ras.

AGRADECIMENTOS

À professora Maria Christina Soares Rebello, pela colaboração na discussão do trabalho.

REFERÊNCIAS

1. Belanger JT. Perillyl alcohol: applications in oncology. Altern Med Rev. 1998;3(6):448-57.
2. Haag JD, Lindstrom MJ, Gould MN. Limonene-induced regression of mammary carcinomas. Cancer Res. 1992;52(14):4021-6.
3. Stark MJ, Burke YD, McKinzie JH, Ayuobi AS, Crowell PL. Chemotherapy of pancreatic cancer with the monoterpene perillyl alcohol. Cancer Lett. 1995;96(1):15-21.
4. Mills JJ, Chari RS, Boyer IJ, Gould MN, Jirtle RL. Induction of apoptosis in liver tumors by the monoterpene perillyl alcohol. Cancer Res.1995;55(5):979-83.
5. Jeffers L, Church D, Gould M, Wilding G. The effect of perillyl alcohol on the proliferation of human prostatic cell lines. Proc Am Assoc Cancer Res. 1995;36:303.
6. Reddy BS, Wang CX, Samaha H, Lubet T, Steele VE, Kelloff GJ, et al. Chemoprevention of colon carcinogesis by dietary perillyl alcohol. Cancer Res. 1997;57(3):420-5.
7. He L, Mo H, Hadisusilo S, Oureshi AA, Elson CE. Isoprenoids suppress the growth of murine B16 melanomas in vitro and in vivo. J Nutr. 1997;127(5):668-74.
8. Shi W, Gould MN. Induction of differentiation in neuro-2A cells by the monoterpene perillyl alcohol. Cancer Lett. 1995;95(1-2):1-6.
9. Kawamura MT. Estudo das alterações moleculares em soros de pacientes com câncer de pulmão[tese]. Rio de Janeiro: Universidade Federal do Rio de Janeiro; 2002. 98p.
10. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytoxicity assays. J Immunol Methods. 1983;65(1-2):55-63.
11. Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970;227(5259):680-5.
12. Kanji GK. 100 statistical tests. London: Sage;1983.
13. Medronho RA, Carvalho DM, Bloch KV, Luiz RR, Werneck GL. Epidemiologia. São Paulo: Atheneu; 2003.
14. Marshall CJ. Specificity of receptor tyrosine kinase signaling: transient versus sustained extracellular signal- regulated kinase activation. Cell. 1995;80(2):179-85.
15. Hunter T. Protein kinase and phosphatases: the yin and yang of protein phosphorylation and signaling. Cell.1995;80(2):225-36.
16. Hill CS, Treisman R. Transcriptional regulation by extracellular signals: mechanism and specificity. Cell. 1995;80(2):199-211.
17. Cobb MH, Goldsmith EJ. How MAP kinases are regulated. J Biol Chem.1995;270(25):14843-6.
18. Burack WR, Sturgill TW. The activating dual phosphorylation of MAPK by MEK is nonprocessive Biochemistry. 1997;36(20):5929-33.
________________________________________________________________________________________
* Trabalho realizado no Laboratório de Oncologia Molecular do Instituto de Doença do Tórax do Hospital Universitário Clementino Fraga - Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ - Rio de Janeiro (RJ) Brasil.
Órgão Financiador: Capes e CNPq - Processo número: 5506532002-3
1. Mestre em Medicina pela Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ - Rio de Janeiro (RJ) Brasil.
2. Acadêmico de Iniciação Científica do Hospital Universitário Clementino Fraga - Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ - Rio de Janeiro (RJ) Brasil.
3. Doutor do Setor de Tisiologia do Hospital Universitário Clementino Fraga Filho - Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ - Rio de Janeiro (RJ) Brasil.
4. Professora Adjunta e Chefe do Laboratório da Expressão Gênica do Laboratório do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho - Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ - Rio de Janeiro (RJ) Brasil.
5. Mestrando do Instituto Oswaldo Cruz - IOC - Rio de Janeiro (RJ) Brasil.
Endereço para correspondência: Maria da Gloria da Costa Carvalho. Rua Nascimento Silva, 241/501, Ipanema - CEP:22421-020, Rio de Janerio - RJ, Brasil. Tel: 55 21 2275-9789. E-mail: mgccosta@biof.ufrj.br
Recebido para publicação em 9/3/05. Aprovado, após revisão, em 20/5/05.